基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)/電阻抗法血細(xì)胞分析儀測(cè)試原理
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（一）白細(xì)胞分析原理
50年代初，庫(kù)爾特（W。H。Coulter）發(fā)避孕藥并申請(qǐng)了粒子計(jì)數(shù)技術(shù)的設(shè)計(jì)專利，其理是根據(jù)血細(xì)胞埋傳導(dǎo)的懷質(zhì)，以電解質(zhì)溶液中懸浮的白細(xì)胞在通過(guò)計(jì)數(shù)時(shí)引起的電阻變化進(jìn)行檢查為基礎(chǔ)，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積的測(cè)定，這種方法稱為電阻抗法，也稱為庫(kù)爾特原理（圖2-7）
圖2-7 電阻抗法血細(xì)胞計(jì)數(shù)原理
把用等滲電解質(zhì)溶液（被稱為稀釋液,diluent）稀釋的細(xì)胞懸液侄入一個(gè)不導(dǎo)電的容器中，將小孔管插到細(xì)胞懸液中。小孔管是電阻抗法細(xì)胞計(jì)數(shù)的一個(gè)重要的組成部分，其內(nèi)側(cè)充滿了稀釋液，并有一個(gè)內(nèi)電極，外側(cè)細(xì)胞懸液中有一個(gè)外電極。檢測(cè)期間，當(dāng)電流以接通通后，位于小孔兩側(cè)的電極產(chǎn)生穩(wěn)定的電流。稀釋液通過(guò)小孔孔管壁上固有的小孔（直徑一般<100μm.厚度為75μm左右）向小孔內(nèi)部流動(dòng)。因?yàn)樾】走@壁充滿了具有專導(dǎo)性的液體，其電子脈沖是穩(wěn)定的。如果供給電流I和阻抗Z是穩(wěn)定的，根據(jù)歐姆定期律通過(guò)小孔的電壓E也是不變的（這時(shí)E=IZ）。當(dāng)有一個(gè)細(xì)胞通過(guò)小孔時(shí)，由于細(xì)胞的導(dǎo)電性質(zhì)比稀釋液要低，在電路中小孔感應(yīng)區(qū)內(nèi)的電阻的增加，于瞬間能上能下起了電壓變化而出現(xiàn)一個(gè)脈沖信號(hào)，自然數(shù)為通過(guò)脈沖。電壓增加的變化的程度取決于非傳導(dǎo)的細(xì)胞占據(jù)小孔感應(yīng)區(qū)的體積，即細(xì)胞體積越大，引起的脈沖越，產(chǎn)生的脈沖振幅越高，脈沖信號(hào)經(jīng)過(guò)下列步驟，得出細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。
1．放大：由于血細(xì)胞通過(guò)微孔時(shí)產(chǎn)生的脈搏沖訊號(hào)非常微弱，不能直接觸發(fā)計(jì)數(shù)電路，因此必須通過(guò)電子放大器械，將微伏訊號(hào)放大為優(yōu)級(jí)脈沖扭號(hào)。
2．甄別：通過(guò)微孔時(shí)的各種微粒均可產(chǎn)生相應(yīng)脈沖訊號(hào)，訊號(hào)電平（脈沖幅度）與微粒在小成正比。因除血細(xì)胞外，血中細(xì)胞外，血中細(xì)胞碎片、稀釋液中雜質(zhì)微粒均可產(chǎn)生假訊號(hào)，使計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。所謂甄別就是利用甄別器根據(jù)閾值調(diào)節(jié)器提供的參考電平，將低于參考電平的假訊號(hào)去掉，以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。
3．閾值鹿茸：在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)參考電平的大小，使計(jì)數(shù)結(jié)果可能符合實(shí)際。
4．整形：經(jīng)過(guò)放大和甄別后的細(xì)胞脈沖訊號(hào)波形尚不一致必須經(jīng)過(guò)整形器作用，修整為形伏一致標(biāo)準(zhǔn)的平頂波后，才能觸發(fā)電路。
5．計(jì)數(shù)：血細(xì)胞的脈沖信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大、甄別、整形后，送入計(jì)數(shù)系統(tǒng)。各型血液分析儀器計(jì)數(shù)系統(tǒng)甄別方式不同，通過(guò)各種方式得出計(jì)數(shù)結(jié)果。（圖2-8）
圖2-8 儀器監(jiān)測(cè)屏上顯示白細(xì)胞通過(guò)脈沖
目前很多儀器在給出細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果之外，是時(shí)提供細(xì)胞體積分布圖形，這些可以表示出細(xì)胞群體分布情況的圖形，稱為細(xì)胞分布直方圖（圖2-9）。直方圖是由測(cè)量通過(guò)感應(yīng)區(qū)的每個(gè)細(xì)胞脈沖累積得到的，是在計(jì)數(shù)的同時(shí)進(jìn)行分析測(cè)量的。如圖2-8所示，示波器顯示的是所分析的細(xì)胞的脈沖大小，圖2-9是相應(yīng)的體積分布直方圖，橫坐標(biāo)為體積，縱坐標(biāo)是血細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，血細(xì)胞分析儀在進(jìn)行細(xì)胞分析時(shí)將每個(gè)細(xì)胞的脈沖根據(jù)其體積大小分配并存在相應(yīng)的體積通道中，每個(gè)通收集的數(shù)據(jù)被統(tǒng)計(jì)出相對(duì)數(shù)并表示在“Y”軸上。體積數(shù)據(jù)以飛機(jī)升（fl）為單位，表示在X軸上。
在進(jìn)行白細(xì)胞體積分析時(shí)，儀器計(jì)算機(jī)部分可以將白細(xì)胞體積從35-450fl 分為256個(gè)通道(channal)，每個(gè)通道為1.64fl，細(xì)胞根據(jù)其大小被分別放在不同的通道中，從而得到白細(xì)胞體積分布的地直方圖。（圖2-10）
圖2-9 細(xì)胞體積直方圖
圖2-10 三部法血液分析儀白細(xì)胞分布直方圖
經(jīng)過(guò)溶血劑處理后的白細(xì)胞可以根據(jù)體積大小初步確認(rèn)其相應(yīng)的細(xì)胞群：第一群是小細(xì)胞區(qū)，主要是淋巴細(xì)胞。第二群是單個(gè)核細(xì)胞區(qū)，也被稱為中間細(xì)胞（MID），包括單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞，核象左移或白血病可有各階段幼稚細(xì)胞及白血病細(xì)胞。第三群是大細(xì)胞區(qū)，主要是中性粒細(xì)胞（GRAN）。儀器根據(jù)各亞群占總體的比例計(jì)算出各亞群的百分率，如果與該標(biāo)本的白細(xì)胞總數(shù)相乘，即得到各類細(xì)胞的絕對(duì)值?？梢钥闯?，電阻法只是根據(jù)細(xì)胞體積的大小，將白細(xì)胞分成幾個(gè)群體。在一個(gè)群體中，可能發(fā)某種細(xì)胞為主（如小細(xì)胞區(qū)主要是淋巴細(xì)胞），但由于細(xì)胞體積間的交叉，可能還有其它細(xì)胞的存在。顯然習(xí)慣上甩稱的“三分類、”“二分類”血細(xì)胞分析儀達(dá)個(gè)名稱是不夠確切的。國(guó)外多采用“三部法”（3-part）或“二部法”(2-part)稱之。國(guó)內(nèi)也有專家建議使用“三分群”或“二分群”描述電阻抗法血細(xì)胞分析儀的白細(xì)胞分類。
（二）紅細(xì)胞測(cè)試原理
根據(jù)各項(xiàng)參數(shù)在血液分析儀檢測(cè)原理的不同，檢測(cè)大致分為三個(gè)部分。
1．紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞比積迄今，絕大多數(shù)血液分析儀使用電阻抗法進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞比積測(cè)定，其原理同白細(xì)胞一樣。紅細(xì)胞通過(guò)小孔時(shí)，形成的相應(yīng)的脈沖的多少即紅細(xì)胞的數(shù)目，脈沖的高度代表單個(gè)脈沖細(xì)胞的體積。脈沖高度疊加經(jīng)換算即可得到紅細(xì)胞的比積（有的儀器先以單個(gè)細(xì)胞高度計(jì)算平均紅細(xì)胞容積（MCV），再乘以紅細(xì)胞的數(shù)得出紅細(xì)胞比積。）稀釋的血液進(jìn)入紅細(xì)胞檢測(cè)通道時(shí)，其中含有白細(xì)胞，因此，紅細(xì)胞檢測(cè)的各項(xiàng)參數(shù)均含有白細(xì)胞因素，但正常血液有形成分中白細(xì)胞比例很少，故其影響可忽略不計(jì)，要某種病理情況下，如白血病，白細(xì)胞數(shù)明顯增加而又伴嚴(yán)重貧血時(shí)，即可使所得務(wù)項(xiàng)參數(shù)產(chǎn)生明顯誤差。根據(jù)所測(cè)單個(gè)紅細(xì)胞體積及相同體積細(xì)胞占總體的比例，可打印出紅細(xì)胞體積分布直方圖。
2．血紅蛋白測(cè)定：任何類型、檔次的血細(xì)胞分析儀，血紅蛋白測(cè)定原理是相同的。被稀釋的血液的加入溶血?jiǎng)┖螅t細(xì)胞溶解，釋放血紅蛋白，后者與溶血?jiǎng)┙Y(jié)合形成血紅蛋白衍生物，進(jìn)入血紅蛋白測(cè)試系統(tǒng)，在特定波長(zhǎng)（一般在530-550nm）下比色，吸光度的變化與液體中Hb含量成比例，儀器便可顯示Hb濃度。不同系列血液分析儀配套溶血?jiǎng)┡浞讲煌纬傻难t蛋白衍生物亦不同，吸光度各異但最大吸收峰均接近540nm .這是因?yàn)镮CSH推薦的氰化高鐵法，HICN最大吸收峰在540nm。校正儀器必須以HICN值為標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)系列血液分析儀溶血?jiǎng)﹥?nèi)均含有氰化鉀，與血紅蛋白作用后形成氰化血紅蛋白（注意不是氰化高鐵血紅蛋白），其特點(diǎn)是顯色穩(wěn)定，最大吸收峰接近540nm，但吸收光譜與HICN有明顯的不同。此點(diǎn)在儀器校正時(shí)應(yīng)十分注意。
為了減少溶血?jiǎng)┑?a href="/w/%E6%AF%92%E6%80%A7" title="毒性">毒性，避免含氰化的血紅蛋白衍生物檢測(cè)后的污物處理，近年來(lái)，有些血液分析儀使用非氰化溶血?jiǎng)ㄈ鏢LS-HB）實(shí)驗(yàn)證明，形成的衍生物與HICN吸收光譜相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性達(dá)到含有氰化物溶血?jiǎng)┩瑯铀?。既保證了實(shí)驗(yàn)質(zhì)量又避錫了試劑對(duì)分析人員的毒性和環(huán)境污染。
3．各項(xiàng)紅細(xì)胞指數(shù)檢測(cè)原理：同一手工法一樣，MCV、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）均是根據(jù)儀器檢測(cè)，的紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積和血紅蛋白量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)內(nèi)存電腦換算出來(lái)的。
RDW由血液分析儀器測(cè)量后獲得，是反映外周血紅細(xì)胞體積異質(zhì)性的參數(shù)。簡(jiǎn)言之，是反映紅細(xì)胞大小不等的客觀指標(biāo)。多數(shù)儀器用所測(cè)紅細(xì)胞體積大小的變異系數(shù)來(lái)表示，即RDW-CV，也有的儀器采用RDW-SD報(bào)告方式。
紅細(xì)胞通進(jìn)小孔的一瞬間，計(jì)數(shù)電路得到一個(gè)相應(yīng)的大小的脈沖，脈沖的高度是由細(xì)胞體積大小決定的，不同大小的脈沖的信號(hào)分別貯存在儀器內(nèi)裝計(jì)算機(jī)的不同通道內(nèi)，計(jì)算出相應(yīng)的體積及細(xì)胞數(shù)后，統(tǒng)計(jì)處理而得RDw 值。由于RDw 來(lái)自十幾秒內(nèi)近萬(wàn)個(gè)紅細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)，不但愿可以克服測(cè)量紅細(xì)胞直徑時(shí)人為制片因素和主觀因素等影響，還較P-J曲線更能直接、客觀、及時(shí)地反映紅細(xì)胞大小不等程度，對(duì)貧血的診斷有重要意義。RDW的正常參考范圍見(jiàn)表2-4。
表2-4 RDW正常參考范圍
| 作者 | 例數(shù) | RDW（<1.64SDX） | 報(bào)告時(shí)間（年） |
| Bassman | 229 | <13.9 | |
| McClure | 90 | <14.8 | 1985 |
| Robert | 29 | <12.1 | 1985 |
| Marti | 61 | <48(RCSDW) | 1987 |
| 叢玉隆 | 81（兒童） 70（成年） 60（老年） |
<14.6 <14.0 <13.8 |
1990 |
| 叢玉隆等 | 2013 | <14.9 | 1996 |
- 為北京協(xié)作組六家醫(yī)院使用五種型號(hào)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀調(diào)查2013例成人（男1013例，女1000例）RDW結(jié)果。
（三）血小板分析原理
目前有半自動(dòng)、全自動(dòng)兩種血細(xì)胞分析儀器儀器的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)微孔旁有一股穩(wěn)定持續(xù)的稀釋液流，稱掃洗液體。其流向與孔呈直角，使計(jì)數(shù)后的流體流走，可防止計(jì)數(shù)后細(xì)胞重新進(jìn)入循環(huán)。計(jì)算機(jī)還可進(jìn)行一次校正，即對(duì)有多個(gè)細(xì)胞是時(shí)經(jīng)過(guò)通道時(shí)，只計(jì)一個(gè)脈沖數(shù)情況的校正。校正指數(shù)與計(jì)數(shù)值多少相關(guān)。另釘，用一個(gè)脈沖編排器消除中心軸外的顆粒計(jì)數(shù)及檢測(cè)各種細(xì)胞經(jīng)小孔時(shí)引起的電阻變化，脈沖經(jīng)數(shù)學(xué)化后，數(shù)字被送到記憶線路全程，儲(chǔ)存于體積通道中，形成直方圖。血小板計(jì)數(shù)儲(chǔ)存于64道直方圖范圍為2-20fl。不同儀器血小板直方圖的范圍不一。平均血小板體積就是此平整曲線所含的群體算術(shù)平均體積，所以MPV也就是PLT大小分布直方圖的產(chǎn)物。為了使血小板更準(zhǔn)確，有些儀器專門(mén)設(shè)置了增加血小板準(zhǔn)確性的技術(shù)，如鞘流技術(shù)、浮動(dòng)界標(biāo)、擬合曲線等。
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